การทำให้ผลิตภัณฑ์จากจุลินทรีย์บริสุทธิ์
(Purification of Microbial Products)
ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.อรุณ ชาญชัยเชาว์วิวัฒน์
สาขาวิชาจุลชีววิทยา
คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
มหาวิทยาลัยราชภัฏบ้านสมเด็จเจ้าพระยา
Asst. Prof. Arun Chanchaichaovivat, Ph.D.
Program in Microbiology
Faculty of Science and Technology
Bansomdejchaopraya Rajabhat University
ผลิตภัณฑ์จากจุลินทรีย์ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงพบได้ทั้งภายในเซลล์และหลั่งออกมาภายนอกเซลล์มักอยู่ในรูปของสารละลายซึ่งมีน้ำและสารอื่นๆ ปะปนอยู่ด้วย ขั้นตอนการทำให้ผลิตภัณฑ์จากจุลินทรีย์บริสุทธิ์ต้องใช้วิธีทั้งการสกัดแยกและทำให้บริสุทธิ์ควบคู่กันไปจึงจะสามารถกำจัดสารอื่นๆ ที่ปนเปื้อนอยู่ออกไปได้ ขั้นตอนนี้จึงค่อนข้างยุ่งยากและทำให้เสียค่าใช้จ่ายส่วนหนึ่ง อย่างไรก็ตามการจะเลือกใช้วิธีใดนั้นขึ้นอยู่กับชนิดของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการแยก ความต้องการให้ผลิตภัณฑ์มีความบริสุทธิ์เพียงใด หรือยอมให้มีสารประกอบอื่นปะปนอยู่กับผลิตภัณฑ์มากน้อยเพียงใด เป็นต้น สำหรับวิธีการใช้แยกสารและทำให้สารบริสุทธิ์สามารถทำได้ดังนี้
1. การสกัดแยกด้วยตัวทำละลาย (solvent extraction)
วิธีนี้ใช้แยกสารออกจากกันและทำสารให้บริสุทธิ์โดยอาศัยสมบัติการละลายของสารใน
ตัวทำละลาย (solvent) ที่แตกต่างกัน ดังนั้นจึงควรใช้ตัวทำละลายที่เหมาะสมในการสกัดสารที่ต้องการออกจากสารผสม ตัวทำละลายที่ดีควรมีคุณสมบัติดังนี้คือ สามารถละลายสารที่ต้องการสกัดได้ ไม่ละลายสารอื่นๆ ที่ไม่ต้องการ ไม่ทำปฏิกิริยากับสารที่ต้องการสกัดแยก สามารถแยกตัวทำละลายออกจากผลิตภัณฑ์ได้ง่าย ไม่เป็นพิษ และมีราคาถูก (Meullemiestre et al., 2015) ตัวทำละลายที่นิยมใช้ ได้แก่ โพรพานอล (propanol) บิวทิลแอซิเทต (butylacetate) อีเทอร์ (ether) เป็นต้น ตัวอย่างของการสกัดแยกผลิตภัณฑ์จากจุลินทรีย์โดยวิธีนี้ ได้แก่ การสกัดแยกคาโรทีนอยด์ (carotenoid) ซึ่งทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เมทานอล (methanol) การใช้เมทานอลเป็นตัวทำละลายมีข้อดีคือ ทำให้เซลล์กระจายได้ดี ทำให้สารประกอบไลโปโปรตีน (lipoprotein complexs) ที่เป็นองค์ประกอบของเยื่อหุ้มเซลล์แตกออกและมีความเป็นโพลาร์ (polar) มากพอที่สามารถสกัดแยกคาโรทีนอยด์ ซึ่งมีคุณสมบัติเป็นพวกโพลาร์ออกมาได้ดี การสกัดด้วยตัวทำละลายสามารถใช้แยกผลิตภัณฑ์ชนิดอื่นๆ ในระดับอุตสาหกรรมได้สะดวกและรวดเร็วอีกด้วย เช่น สามารถสกัดแยกเพนิซิลลินได้ภายในเวลา 90 นาที นอกจากนี้ยังเป็นวิธีที่เหมาะสมกับผลิตภัณฑ์ที่มีความคงทนน้อย เนื่องจากสามารถสกัดผลิตภัณฑ์ออกมาได้อย่างรวดเร็วนั่นเอง
2. การทำให้ตกตะกอน (precipitation)
วิธีนี้เป็นการทำให้ผลิตภัณฑ์ตกตะกอนแยกตัวออกจากสารชนิดอื่นที่ปะปนอยู่โดยอาศัยคุณสมบัติในการละลายเป็นหลักเช่นเดียวกับการใช้ตัวทำละลายในการสกัดสาร แต่ต่างกันที่ต้องทำให้สารที่ต้องการแยกไม่สามารถละลายได้จนในที่สุดตกตะกอนแยกออกมา (Bonner, 2019) ในขณะที่สารตัวอื่นอยู่ในสภาพของสารละลาย สารที่ใช้เพื่อทำให้ผลิตภัณฑ์ตกตะกอน ได้แก่ ตัวทำละลายอินทรีย์ (organic solvent) ชนิดต่างๆ เช่น อีเทอร์ แอลกอฮอล์ และแอซิโทน (acetone) หรือใช้สารละลายเกลือความเข้มข้นแตกต่างกัน เช่น สารละลายเกลือแอมโมเนียซัลเฟต นอกจากนี้สารละลายกรดความเข้มข้นต่างๆ กัน ก็สามารถช่วยตกตะกอนสารได้ เช่น การตกตะกอนโปรตีนด้วยกรดไทรคลอโรแอซิทิก (trichloroacetic acid) เข้มข้นร้อยละ 5 นอกจากนี้อาจใช้วิธีการปรับค่าความเป็นกรด-เบสของสารละลายให้เป็นกลาง เพื่อให้สารที่ต้องการตกตะกอนออกจากสารอื่นๆ ได้เช่นกัน ตัวอย่างการสกัดแยกและทำให้ผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ด้วยวิธีทำให้ตกตะกอน ได้แก่ การแยกเอนไซม์เพคทิเนส (pectinase) จากรา เอนไซม์นี้เป็นเอนไซม์ที่ปล่อยออกมานอกเซลล์สามารถแยก
ออกจากอาหารเลี้ยงจุลินทรีย์ได้โดยการทำให้ตกตะกอนด้วยแอลกอฮอล์เข้มข้นร้อยละ 95 ที่อุณหภูมิต่ำ จากนั้นทำการแยกตะกอนออกมาด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยง (centrifuge) และทำให้เอนไซม์แห้งด้วยเครื่องทำให้แห้งแบบสุญญากาศ (vacuum drying) อีกตัวอย่างหนึ่งคือ การแยกกรดซิทริก (citric acid) จากรา Aspergillus niger โดยการกรองแยกเส้นใยออกจากน้ำหมัก แล้วนำน้ำหมักมาเติมด้วยสารละลายแคลเซียมไฮดรอกไซด์ [Ca(OH)2] ที่บริสุทธิ์ จะทำให้เกิดตะกอนของแคลเซียมซิเตรท (calcium citrate) ขึ้น จากนั้นนำตะกอนมาล้างสิ่งเจือปนออกหลายๆ ครั้ง
3. การใช้วิธีโครมาโทกราฟี (chromatography)
วิธีโครมาโทกราฟีเป็นวิธีการแยกสารให้บริสุทธิ์ โดยอาศัยคุณสมบัติด้านต่างๆ ของสารที่แตกต่างกัน เช่น ขนาดโมเลกุล ประจุ คุณสมบัติการละลายในตัวทำละลาย และความสามารถในการถูกดูดซับ ระบบโครมาโทกราฟีประกอบด้วยองค์ประกอบที่สำคัญอยู่ 2 ส่วน คือ ส่วนไม่เคลื่อนที่ (stationary phase) ซึ่งอาจเป็นของแข็งอิสระหรือของเหลวที่เกาะหรือฉาบอยู่บนตัวค้ำจุน (supporting medium) ส่วนนี้จะอยู่กับที่และเป็นบริเวณที่สารที่ต้องการแยกจะแยกเคลื่อนที่ผ่านไป อีกส่วนหนึ่งคือส่วนเคลื่อนที่ (mobile phase) อาจเป็นของเหลวหรือแก๊สที่ทำหน้าที่ชะแยกสารออกจากส่วนไม่เคลื่อนที่จากปลายด้านหนึ่งไปสู่ปลายอีกด้านหนึ่ง ส่วนไม่เคลื่อนที่มักมีลักษณะเป็นผงละเอียดและมีพื้นที่ผิวมาก เช่น สารอะลูมินา (alumina, Al2O3) ซิลิกาเจล (silica gel, SiO2) หรืออาจจะใช้วัสดุที่สามารถดูดซับได้ดี เช่น ชอล์ก (chalk) หรือ กระดาษ เป็นต้น ส่วนเคลื่อนที่ทำหน้าที่ชะเอาสารผสมออกจากส่วนไม่เคลื่อนที่ให้ไหลตามไปด้วย การที่สารจะเคลื่อนที่ไปได้มากหรือน้อยขึ้นอยู่กับแรงดึงดูดระหว่างสารผสมกับตัวดูดซับในส่วนที่ไม่เคลื่อนที่ สารที่ใช้เป็นส่วนเคลื่อนที่ ได้แก่ สารพวกตัวทำละลาย เช่น ปิโตรเลียมอีเทอร์ (petroleum ether) เฮกเซน (hexane) คลอโรฟอร์ม (chloroform) เป็นต้น ข้อดีของการแยกสารด้วยวิธีโครมาโทกราฟี คือ สามารถแยกสารผสมที่มีปริมาณน้อยได้ทั้งสารที่มีสีและไม่มีสี ใช้ได้ทั้งปริมาณวิเคราะห์ (สามารถบอกปริมาณสารได้) และคุณภาพวิเคราะห์ (สามารถบอกชนิดของสารได้) การทำระบบโครมาโทกราฟี สามารถทำได้หลายวิธีขึ้นอยู่กับส่วนที่ไม่เคลื่อนที่มีลักษณะอย่างไร ดังนี้
3.1 โครมาโทกราฟีแบบคอลัมน์ (column chromatography) เป็นวิธีที่ใช้ตัวดูดซับบรรจุในหลอดแก้วยาว นิยมใช้อะลูมินาหรือซิลิกาเจลเป็นส่วนไม่เคลื่อนที่และเป็นตัวดูดซับ สารผสมที่ต้องการแยกในรูปของสารละลายจะถูกเทใส่คอลัมน์ทางด้านบน สารละลายจะผ่านคอลัมน์ลงมาช้าๆ โดยตัวทำละลายที่เป็นส่วนเคลื่อนจะชะพาสารต่างๆ ในสารผสมออกไปด้วยอัตราเร็วต่างกัน ส่วนประกอบใดของสารผสมที่ถูกดูดซับได้ดีจะเคลื่อนที่ช้า ส่วนสารที่ถูกดูดซับไม่ดีจะเคลื่อนที่ได้เร็วทำให้สารผสมแยกจากกันได้
3.2 โครมาโทกราฟีแบบชั้นบาง (thin layer chromatography) เป็นโครมาโทกราฟีแบบระนาบโดยทำให้ส่วนที่ไม่เคลื่อนที่มีลักษณะเป็นครีมข้น เช่น ใช้ซิลิกาเจลนำไปเคลือบบนแผ่นกระจกให้มีความหนาเท่ากันตลอดทั้งแผ่นแล้วนำไปอบให้แห้ง เมื่อนำมาใช้ให้หยดของเหลวสารผสมที่ต้องการแยกบนแผ่นที่เคลือบนี้ แล้วนำแผ่นเคลือบไปจุ่มในภาชนะที่บรรจุตัวทำละลายซึ่งทำหน้าที่เป็นส่วนเคลื่อนที่ โดยให้ระดับของตัวทำละลายอยู่ต่ำกว่าระดับของจุดที่หยดสารผสมไว้ ตัวทำละลายจะซึมไปตามแผ่นเคลือบที่ทำหน้าที่เป็นตัวดูดซับ เมื่อตัวทำละลายซึมถึงจุดที่หยดสารผสมไว้ ตัวทำละลายจะชะพาองค์ประกอบสารผสมไปด้วยอัตราเร็วที่ต่างกันขึ้นอยู่กับสภาพมีขั้วของสารที่ถูกชะและสารที่เป็นตัวทำละลาย โดยถ้าตัวทำละลายเป็นโมเลกุลชนิดมีขั้วก็จะชะเอาสารในสารผสมที่เป็นสารมีขั้วไปได้เร็วแต่สารที่ไม่มีขั้วในสารผสมจะถูกชะไปได้ช้า ในที่สุดสารผสมก็จะแยกออกจากกัน
3.3 โครมาโทกราฟีแบบกระดาษ (paper chromatography) จัดว่าเป็นโครมาโทกราฟี ชนิดระนาบ อีกแบบหนึ่ง โดยอาศัยหลักการและวิธีการเหมือนกับโครมาโทกราฟีแบบชั้นบาง แต่ต่างกันตรงที่ส่วนไม่เคลื่อนที่ จะใช้กระดาษชนิดพิเศษเป็นตัวดูดซับแทนกระจกที่เคลือบด้วยซิลิกาเจล
3.4 โครมาโทกราฟีระบบแก๊สและของเหลว (liquid gas chromatography) สามารถแบ่งได้เป็น 2 ประเภท คือโครมาโทกราฟีของเหลวแบบสมรรถนะสูง (high performance liquid chromatography, HPLC) และโครมาโทกราฟีระบบแก๊ส (gas chromatography, GC) ซึ่งปัจจุบันวิธีโครมาโทกราฟีระบบแก๊สและของเหลวได้ถูกพัฒนาให้สามารถทำงานทั้งในการวิเคราะห์เชิงคุณภาพและการวิเคราะห์เชิงปริมาณได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำมากขึ้น
4. การใช้การกรองระบบเมมเบรน (membrane filtration)
เมมเบรนเป็นเยื่อเลือกผ่าน (semipermeable membrane) ชนิดหนึ่งคือยอมให้สารบางอย่างผ่านไปได้ วิธีการนี้สามารถแยกผลิตภัณฑ์ที่มีโมเลกุลขนาดต่างกันได้แต่ควรใช้แรงดันสุญญากาศ (vacuum pump) ช่วยให้การกรองเร็วขึ้น สำหรับการกรองแบบไมโครฟิลเทรชัน (microfiltration) เป็นการกรองในระดับที่ละเอียดกว่าการกรองแบบใช้กระดาษกรอง ซึ่งยอมให้อนุภาคขนาดประมาณมากกว่า 0.1ไมครอน ผ่านไปได้ เช่น การทำไดอะไลซิส (dialysis) โดยที่อนุภาคไวรัส คอลลอยด์ และสารแมโครโมเลกุล (macromolecule) ไม่สามารถผ่านเมมเบรนออกไปได้และยังคงติดอยู่ที่เยื่อเมมเบรน (Brock, 2014) สำหรับการกรองระดับอัลตร้าฟิลเทรชัน (ultrafiltration) สามารถกรองสารที่มีขนาด 10-150 อังสตรอม อนุภาคที่ผ่านไปได้ เช่น น้ำ อิออน (ion) และแก๊สที่ละลายในของเหลวได้ ระบบกรองแบบรีเวิร์สออสโมซิส (reverse osmosis) สามารถกรองผลิตภัณฑ์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำกว่า 500 เช่น เกลือ หรือกลูโคส ภายใต้ความดัน 500-100 บาร์ (bar) ผลิตภัณฑ์ที่นิยมใช้วิธีกรองด้วยเมมเบรน ได้แก่ โปรตีน แบคทีเรีย และยีสต์ เป็นต้น ชนิดของเมมเบรนที่ใช้ เช่น เซลลูโลสแอซิเทต (cellulose acetate) เซลลูโลสเอสเทอร์ (cellulose ester) และพอลิคาร์บอเนต (polycarbonate) เป็นต้น การกรองผลิตภัณฑ์ด้วยระบบเมมเบรนจะทำให้ผลิตภัณฑ์มีความเข้มข้นเพิ่มขึ้นและบริสุทธิ์ขึ้น
5. การทำให้ตกผลึก (crystallization)
การทำให้ตกผลึกเป็นวิธีทำให้สารบริสุทธิ์หรือเป็นวิธีแยกสารออกจากกันได้วิธีหนึ่ง สามารถทำได้โดยเลือกตัวทำละลายที่เหมาะสมมาสกัดสารที่ต้องการแล้วนำมาตกผลึก การที่สารมีคุณสมบัติละลายได้ต่างกันมากจะทำให้ตกผลึกแยกออกจากกันได้ วิธีการโดยการนำของแข็งมาละลายในตัวทำละลายแล้วทำให้สารละลายอิ่มตัวที่อุณหภูมิสูง กรองสารละลายขณะร้อนเพื่อกำจัดสิ่งเจือปนที่ไม่ละลายออกไป เมื่อปล่อยให้เย็นจะตกผลึกออกมาและได้ผลึกที่บริสุทธิ์ (Lewis et al., 2015) ผลึก (crystal) เป็นของแข็งเนื้อเดียวกันที่มีรูปทรงเรขาคณิตที่มีรูปทรงและมุมระหว่างผิวหน้าแน่นอน ผิวหน้าเรียบ มีพันธะเคมียึดอะตอมต่างๆ ในผลึกไว้ด้วยกัน อนุภาคของผลึกจัดเรียงตัวกันอย่างมีระเบียบแบบแผน เมื่อได้รับแรงกระทบกระเทือนจะหลุดออกจากกันเป็นชั้นๆ ตามแนวผิวหน้าตัดของผลึก ของแข็งแต่ละชนิดจะมีรูปร่างผลึกเฉพาะตัว ผลิตภัณฑ์ที่แยกได้โดยการตกผลึกนั้นจะต้องมีความเข้มข้นและความบริสุทธิ์สูง การทำให้สารละลายของผลิตภัณฑ์มีความเข้มข้นสูงอาจทำได้โดยการระเหย (evaporation) ที่อุณหภูมิสูง แต่การเพิ่มอุณหภูมิอาจทำให้สารบางอย่าง เช่น โปรตีนเสียสภาพทางธรรมชาติได้ เมื่อได้สารละลายเข้มข้นแล้วจึงปล่อยให้สารที่ต้องการ
ตกผลึกลงอย่างช้าๆ จะช่วยให้สารนั้นแยกตัวออกมาจากสิ่งปนเปื้อนอื่นได้ ทำให้ได้สารที่มีความบริสุทธิ์สูงขึ้น แต่ถ้าสารตกผลึกเร็วเกินไปอาจห่อหุ้มสิ่งเจือปนอื่นไว้ภายทำให้ได้สารที่มีความบริสุทธิ์น้อยลง ในทางตรงกันข้ามหากตั้งทิ้งไว้ให้ตกผลึกเป็นเวลานานเกินไปสารอื่นๆ ที่ไม่ต้องการอาจตกตะกอนลงมาปะปนได้เช่นกัน ผลผลิตของสารที่ได้จากการตกผลึกจะน้อยกว่าสารตั้งต้นเสมอเช่นเดียวกับการสกัดด้วยตัวทำละลายและการตกตะกอนเพราะไม่สามารถแยกสารออกได้สมบูรณ์ทั้งหมด อุตสาหกรรมหมักที่ใช้วิธีนี้ ได้แก่ อุตสาหกรรมการผลิตกรดอินทรีย์ เช่น การตกผลึกกรดซิทริกซึ่งทำในขั้นสุดท้ายของการเก็บเกี่ยวผลิตภัณฑ์ การตกผลึกกรดอิทาโคนิก (itaconic acid) โดยการระเหยให้สารละลายกรดเข้มข้นแล้วทิ้งไว้ที่อุณหภูมิต่ำให้เกิดผลึก การตกผลึกกรดฟูมาริก (fumaric acid) โดยปรับสภาพสารละลายกรดที่อยู่ในน้ำหมักให้เป็นกรดจนเกิดผลึกขึ้นแล้วแยกผลึกออกด้วยน้ำร้อน เป็นต้น
บทสรุป
วิธีการทำให้ผลผลิตจากจุลินทรีย์บริสุทธิ์อาศัยสมบัติที่แตกต่างกันของผลิตภัณฑ์แต่ละชนิด ซึ่งนับว่าเป็นขั้นตอนหลังจากจุลินทรีย์ผลิตสารที่ต้องการเต็มที่แล้ว ขั้นตอนนี้จะซับซ้อนมากน้อยเท่าใดขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ของการผลิตว่าต้องการผลิตภัณฑ์ที่มีลักษณะอย่างไร มีความบริสุทธิ์มากน้อยเพียงใด ถ้าขั้นตอนยิ่งมากจะทำให้เสียค่าใช้จ่ายมากขึ้นและจะทำให้ผลิตภัณฑ์มีราคาแพงขึ้นด้วย อย่างไรก็ตามในงานบางอย่างจำเป็นต้องทำให้ผลิตภัณฑ์มีความบริสุทธิ์สูง เช่น ยาปฏิชีวนะ ฮอร์โมน และวิตามิน ที่ใช้ในทางการแพทย์ เป็นต้น ผลิตภัณฑ์หลายชนิดจำหน่ายในรูปผงแห้งทั้งนี้เพื่อให้เก็บรักษาได้นาน สะดวกในการขนส่งและประหยัดพื้นที่ในการเก็บรักษา บางชนิดอาจจำหน่ายในรูปของเซลล์ที่ไม่จำเป็นต้องสกัดผลิตภัณฑ์ออกมาหรือทำให้บริสุทธิ์ก็สามารถนำไปใช้ได้ในงานบางประเภท
เอกสารอ้างอิง
Bonner, P.L.R. (2019). Protein Purification. 2 nd ed. Boca Raton: CRC Press.
Brock, T.D. (2014). Membrane Filtration. Berlin: Springer.
Lewis, A., Seckler, M., Kramer, H. and Rosmalen, G.V. (2015). Industrial Crystallization.
Cambridge: Cambridge University Press.
Meullemiestre, A., Breil, C., Abert-Vian, M. and Chemat, F. (2015). Modern Techniques and
Solvents for the Extraction of Microbial Oils. Switzerland: Springer.
